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服務(wù)目錄號：#OGF-011

服務(wù)項目：改善缺鐵性貧血功能評價

1 動物實驗

1.1 原理

用低鐵飼料喂飼動物可形成實驗性缺鐵性貧血模型，再給予受試樣品，觀察其對血液細(xì)胞學(xué)、血液生化

學(xué)等指標(biāo)的影響，可判定該受試樣品對改善動物缺鐵性貧血的作用。

1.2 實驗動物

健康初斷乳大鼠，單一性別，每組大鼠8－12 只。

1.3 低鐵飼料

配方：

1.4 劑量分組及受試樣品給予時間

實驗設(shè)三個劑量組和一個低鐵對照組，以人體推薦量的5 倍為其中的一個劑量組，另設(shè)二個劑量組，必要時設(shè)陽性對照組（硫酸亞鐵或乳酸亞鐵，劑量為 2 ppm 或 2 mg/kg BW，以 Fe 元素計）。受試樣品給予時間 30天，必要時可延長至 45 天。

1.5 實驗步驟

1.5.1 建立缺鐵性貧血大鼠模型

選用健康斷乳大鼠在實驗環(huán)境下適應(yīng)3－5 天后飼予低鐵飼料及去離子水（或雙蒸水），采用不銹鋼籠及食罐，同時，采用剪尾取血法放血，5 天一次，每次 0.3－0.5ml。實驗過程中避免鐵污染。自第 3 周開始每周選取部分大鼠采尾血測 Hb，如多數(shù)動物 Hb 低于 100g/L 時，測定全部大鼠的體重及 Hb。

1.5.2 恢復(fù)實驗

選取Hb<100g/L 的大鼠作為實驗動物，根據(jù)貧血大鼠 Hb 水平和體重將其隨機(jī)分為低鐵對照組和三個實驗組，各組均繼續(xù)飼予低鐵飼料，低鐵對照組給予相應(yīng)溶劑，實驗組分別給予不同劑量的受試樣品，受試樣品給予時間 30 天，必要時可延長至 45 天，測定體重及各項血液學(xué)指標(biāo)。

1.6 觀察指標(biāo)

體重、血紅蛋白、紅細(xì)胞壓積/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉。

1.6.1 血紅蛋白測定（氰化高鐵法）

消光系數(shù)法和標(biāo)準(zhǔn)曲線法任選其一測定血紅蛋白。在滿足實驗方案和儀器要求的前提下，也可采用血液分析儀測定。

1.6.1.1 吸光系數(shù)法

1.6.1.1.1 原理

血紅蛋白（haemoglobin，Hb）被鐵氰化鉀氧化后生成高鐵血紅蛋白，再與氰離子結(jié)合形成氰化高鐵血紅蛋白（紅色）， 氰化高鐵血紅蛋白（紅色）極為穩(wěn)定，在 540nm 波長下，摩爾吸光系數(shù)為 44000，據(jù)此，用分光光度法測其光密度，運用吸光系數(shù)作血紅蛋白的定量測定。

1.6.1.1.2 儀器

分光光度計。

10 微升微量吸管。

1.6.1.1.3 試劑

稱取碳酸氫鈉（NaHCO3，AR）140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg，用水溶解并稀釋到 1000mL。貯存于棕色試劑瓶內(nèi)，在暗處或冰箱（4℃）保存，至少可穩(wěn)定數(shù)月到 1 年。

1.6.1.1.4 實驗步驟

1.6.1.1.4.1 取試劑 2.5mL 于 5mL 帶蓋試管中，加入 10μL 血液，混勻后，放置 15 分鐘。

1.6.1.1.4.2 選用 0.5 厘米光徑比色杯，于 540nm 波長下，以試劑調(diào)零點，將所得樣品管之光密度乘以 736，

即為血紅蛋白濃度（g/L）。

計算公式如下：

Ct=待測的血紅蛋白（g/L）濃度。

= 氰化高鐵血紅蛋白在 540nm 波長下測出的光密度。

251 = 測定時血液的稀釋倍數(shù)（血 10μL 加入試劑 2.5mL 中）

44000 = 氰化高鐵血紅蛋白的摩爾吸光系數(shù)

0.5 = 比色杯的光徑

64458 = 血紅蛋白的分子量

1.6.1.1.5 注意事項

1.6.1.1.5.1 試劑不要放在聚乙烯瓶內(nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。

1.6.1.1.5.2 儀器因摩爾吸光系數(shù)法完全依靠儀器的吸光度來計算，故此法要求所用的儀器性能要符合要求（如儀器的波長準(zhǔn)確與否，以及靈敏度及線性等），否則將直接影響測定的結(jié)果。

1.6.1.1.5.3 儀器在使用前最好應(yīng)以 WHO 規(guī)定的氰化高鐵血紅蛋白參考液校正后再使用。參考液最好選用ICSH（國際血液學(xué)標(biāo)準(zhǔn)化委員會）確定的由 RIV（荷蘭國立公共衛(wèi)生研究院）制作的氰化高鐵血紅蛋白參考液或上海醫(yī)學(xué)化驗所制備的氰化高鐵血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。

1.6.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線法

1.6.1.2.1 原理

血紅蛋白（hemoglobin，Hb）在鐵氰化鉀和氰化鉀的作用下生成極為穩(wěn)定的氰化高鐵血紅蛋白（紅色），其顏色深淺與血紅蛋白的含量成正比。用分光光度計在 540nm 波長下，測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度，制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，測得待測樣品的吸光度后查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可得 Hb 的濃度。

1.6.1.2.2 儀器

10μL 血色素吸管（或定量毛細(xì)管）

5mL 或 10mL 帶蓋試管

分光光度計1.6.1.2.3 試劑

稱取碳酸氫鈉（NaHCO₃，AR）140mg、鐵氰化鉀 200mg、氰化鉀 50mg，用蒸餾水溶解并稀釋到 1000mL， 貯存于棕色試劑瓶內(nèi)，保存于 4℃冰箱可穩(wěn)定至 1 年。

1.6.1.2.4 實驗步驟

吸取2.5mL 試劑于 5mL 帶蓋試管中，用 10μL 血色素吸管（或定量毛細(xì)管）取大鼠尾血或靜脈血 10μL放置于已放入試劑的試管中；混勻放置 15min。選用 0.5cm 光徑比色杯，于 540nm 波長下，以試劑調(diào)節(jié)儀器零點，測定各樣品管的吸光度，同時測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的吸光度，繪制血紅蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

查標(biāo)準(zhǔn)曲線可求得待測樣品和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的血紅蛋白含量（g/L），計算參考物質(zhì)的回收率。

1.6.1.2.5 注意事項

1.6.1.2.5.1 不要將試劑放在聚乙烯瓶內(nèi)，以免因氰離子與其反應(yīng)而使試劑作用降低。

1.6.1.2.5.2 不宜直接使用消光系數(shù)方法計算血紅蛋白的含量，因為儀器的波長準(zhǔn)確與否、儀器的靈敏度和線性等因素均直接影響測定結(jié)果。

1.6.1.2.5.3 每次測定時，在不同間隔反復(fù)測定血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)液和參考標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（低、中、高 3 個濃度）。

1.6.1.3 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

實驗數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F(xiàn) 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

結(jié)果判定

受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白濃度升高經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，且受試樣品組前后升高幅度平均達(dá)到10g/L 以上，判定該實驗結(jié)果陽性。

1.6.2 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉測定

1.6.2.1 原理

血紅蛋白的合成過程中，幼紅細(xì)胞中的原卟啉在血紅素合成酶的作用下與鐵結(jié)合，當(dāng)鐵供應(yīng)不足時，紅細(xì)胞內(nèi)的原卟啉乃以游離形式累積起來超過正常水平。因此，檢測紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉（Free erythrocyteproloporphyrin，F(xiàn)EP）的含量是檢查缺鐵性紅細(xì)胞生成的有效方法。

血液樣品經(jīng)生理鹽水稀釋后，分別以乙酸乙酯：乙酸混合液（4:1）和 0.5N 鹽酸提取分離血中游離原卟啉，在一定波長下測定其原卟啉的熒光強(qiáng)度而定量。

1.6.2.2 儀器

1.6.2.2.1 熒光分光光度計或 930 型熒光光度計。

1.6.2.2.2 離心機(jī)。

1.6.2.2.3 混旋器。

1.6.2.3 試劑

1.6.2.3.1 肝素抗凝劑 一支 12500 單位的肝素以 0.9%生理鹽水稀釋至 25mL（1mL=500 單位）。

1.6.2.3.2 5 %（W/V）硅藻土生理鹽水懸濁液 稱取 5g 硅藻土加 0.9%生理鹽水至 100mL。

1.6.2.3.3 4:1 乙酸乙酯和乙酸混合液。

1.6.2.3.4 0.5N HCl。

1.6.2.3.5 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)液。

1.6.2.3.5.1 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)貯備液（50mg/L）：稱取5mg 原卟啉，加4mL 無水乙醇使之溶解，以 1.5N HCl 稀釋至100mL。

1.6.2.3.5.2 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)中間液（1.0mg/L）：取2mL 原卟啉貯備液，以乙酸乙酯與乙酸（4:1）混合液稀釋到100mL。

1.6.2.3.5.3 原卟啉標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液（0.1mg/L）：取1mL 原卟啉中間液，以乙酸乙酯與乙酸（4:1）混合液稀釋到10mL。

1.6.2.4 實驗步驟

注：按上表依次加入各種試劑，在加入乙酸乙酯與乙酸混合液前，用混旋器混合已加入的混合液，然后邊混合邊加入乙酸乙酯與乙酸混合液。

離心15 分鐘，將各管上清液分別倒入 10mL 比色管中，每管加 4mL 0.5N 鹽酸，振搖 5 分鐘靜止使之分層，將上層溶劑抽出棄去，測定鹽酸液的熒光強(qiáng)度（30 分鐘內(nèi)比色）。

1.6.2.5 熒光測量

1.6.2.5.1 若使用日立 MPF-4型熒光分光光度計測定條件為激發(fā)波長為 403nm，狹縫10nm；發(fā)射波長為 605nm，狹縫為 5nm，液槽為 1cm 厚石英槽。

1.6.2.5.2 若使用國產(chǎn) 930 型熒光光度計測試，條件為激發(fā)濾光片 420，熒光濾片 550，靈敏度1×500，滿度開關(guān)開至最大，液槽為 1cm 厚石英槽，檢出靈敏度為 0.01μg/4mL。在不同量原卟啉（0μg，0.01μg，0.03μg，0.05μg，0.07μg，0.1μg）呈線性關(guān)系。

1.6.2.6 計算

1.6.2.7 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

實驗數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F(xiàn) 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

結(jié)果判定

受試樣品組與對照組比較，紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉降低經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，即可判定該實驗結(jié)果陽性。

1.6.2.8 注意事項

1.6.2.8.1 熒光強(qiáng)度隨時間延長而逐漸衰退，但 30 分鐘內(nèi)基本穩(wěn)定。

1.6.2.8.2 加乙酸乙酯-乙酸混合液時，一定要邊混合邊加入，否則影響測定結(jié)果。

1.6.2.9 濾紙法測定：

將滴有20 微升血點全部剪下放入試管中，同時取同樣大小空白濾紙放入標(biāo)準(zhǔn)管和空白管中，各管均加入 5%硅藻土懸濁液 0.2 亳升，振蕩后放置過夜，以下步驟同直接法。

計算：

FEP（微克/100 毫升全血）=C/B×A/D×100

A=標(biāo)準(zhǔn)管原卟啉含量（0.02 毫克）

B=標(biāo)準(zhǔn)管熒光強(qiáng)度-空白管熒光強(qiáng)度

C=血樣熒光強(qiáng)度-空白管熒光強(qiáng)度

D=取樣量

1.6.3 紅細(xì)胞壓積測定：使用全自動血細(xì)胞分析儀進(jìn)行。數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定同“1.6.2.7”。

1.7 數(shù)據(jù)處理和結(jié)果判定

實驗數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F(xiàn) 值<F_0.05，

結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F_0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

結(jié)果判定

受試樣品組與低鐵對照組相比，若血紅蛋白差異有顯著性，且其前后平均升高幅度達(dá)到10g/L 以上，同時，受試樣品紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉或紅細(xì)胞壓積與低鐵對照組相比差異有顯著性，可判定該受試樣品改善缺鐵性貧血動物實驗結(jié)果陽性。

1.8 注意事項

本項實驗關(guān)鍵在于貧血模型的建立。低鐵飼料含鐵量最好控制在9mg/kg 以下，所用試劑應(yīng)為分析純，動物飲用水應(yīng)為去離子水或雙蒸水，采用不銹鋼籠具，所用器皿應(yīng)用 10%硝酸溶液處理。實驗過程中嚴(yán)防外來鐵的污染及彼此交叉污染。

2 人體試食試驗

2.1 受試者納入標(biāo)準(zhǔn)

受試者為小細(xì)胞低色素貧血，且有明確的缺鐵原因和臨床表現(xiàn)的成人和兒童。

2.1.1 成人納入標(biāo)準(zhǔn)：男性 Hb 80g/L－130g/L，女性 Hb 80g/L－120g/L。

2.1.2 兒童納入標(biāo)準(zhǔn)：≤6 歲兒童 Hb 70g/L－110g/L；7－18 歲青少年 80g/L－120g/L。

2.2 受試者排除標(biāo)準(zhǔn)

2.2.1 合并有心、腦血管、肝、腎、消化道等嚴(yán)重疾病及精神病患者。

2.2.2 過敏體質(zhì)或?qū)υ撌茉嚇悠愤^敏者。

2.2.3 嚴(yán)重貧血患者。

2.2.4 短期內(nèi)服用與受試功能有關(guān)的物品，影響到對結(jié)果的判斷者。

2.2.5 未按標(biāo)準(zhǔn)服用受試樣品、資料不全影響功效或安全性判斷者。

2.3 試驗設(shè)計及分組要求

采用自身和組間兩種對照設(shè)計。按受試者的血紅蛋白水平隨機(jī)分為試食組和對照組，盡可能考慮影響結(jié)果的主要因素如性別、年齡、經(jīng)濟(jì)狀況等，進(jìn)行均衡性檢驗，以保證組間的可比性。每組受試者不少于50例。

2.4 受試樣品的劑量和使用方法

試食組按推薦服用方法、服用量服用受試產(chǎn)品，對照組可服用安慰劑或采用空白對照，也可服用具有同樣作用的陽性物。受試樣品給予時間30 天，必要時可延長至 120 天。試驗期間不改變原來的飲食習(xí)慣，正常飲食。

2.5 觀察指標(biāo)

2.5.1 安全性指標(biāo)

2.5.1.1 一般狀況（包括精神、睡眠、飲食、大小便、血壓等）

2.5.1.2 血、尿、便常規(guī)檢查

2.5.1.3 肝、腎功能檢查（兒童受試者不測定此項）

2.5.1.4 腹部 B 超、胸片、心電圖檢查（各項指標(biāo)在試驗前檢查一次，兒童受試者不測此項）

2.5.2 膳食調(diào)查

于試驗開始前、結(jié)束前進(jìn)行三天的詢問法膳食調(diào)查，觀察飲食因素對試驗結(jié)果的影響。

2.5.3 癥狀觀察

食欲不振、乏力、煩躁、頭暈、眼花、精神不集中、心慌、氣短等。

2.5.4 功效性指標(biāo)

兒童觀察指標(biāo)：血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉

成人觀察指標(biāo)：血紅蛋白、血清鐵蛋白、血清運鐵蛋白飽和度/紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉

2.5.4.1 血紅蛋白測定：見 1.6.1。

2.5.4.2 血清鐵蛋白測定（放射免疫法）：

2.5.4.2.1 原理

人血清中的鐵蛋白（SF）與加入的 125I 標(biāo)記的 SF 競爭性地與抗鐵蛋白抗體結(jié)合。用第二抗體分離結(jié)合

部分，分別測定總放射性與沉淀物放射性計數(shù)。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)SF 試劑作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而可在曲線上查出相應(yīng)

樣品血清的SF 濃度。

2.5.4.2.2 儀器

離心機(jī)、γ-射線計數(shù)儀。

2.5.4.2.3 試劑

125I－血清鐵蛋白放射免疫分析試劑盒.。

2.5.4.2.4 操作步驟

2.5.4.2.4.1 操作步驟：鐵蛋白測定操作程序和試劑用量（mL）

（見下表）

2.5.4.2.4.2 繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線

以各標(biāo)準(zhǔn)管的B/ B0 %作縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)鐵蛋白濃度為橫坐標(biāo)（對數(shù)邊）作標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品或質(zhì)控由 B/ B0 %

值從曲線上查到相應(yīng)的含量。

2.5.4.2.4.3 結(jié)果計算

2.5.4.2.4.4 注意事項

本實驗為抗原抗體結(jié)合反應(yīng)，操作時要注意防止可引起抗原、抗體失活的因素（如高溫、冰凍等）。

測定時，要防止液體濺出，以免造成同位素污染，使本底值增高。

離心后，抽去上清液時勿將平鋪在管底的免疫復(fù)合物吸起，否則測定結(jié)果不準(zhǔn)確。

非特異管、零管是為鑒定試劑是否符合規(guī)定而設(shè)立的。

血清鐵蛋白濃度也可用酶聯(lián)免疫吸附法測定。具體測定方法按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5.4.3 血清運鐵蛋白飽和度測定

2.5.4.3.1 原理

血清中加入過量的鐵，使血清中的運鐵蛋白全部與鐵結(jié)合，達(dá)到飽和，過剩的鐵用碳酸鎂吸附除去，然后按測血清鐵的方法，測定總結(jié)合的鐵量，即為總鐵結(jié)和力。從中可計算出未飽和鐵量及血清運鐵蛋白飽和度。

2.5.4.3.2 血清鐵測定

血清鐵（SI）是指存在于血清中與血清運鐵蛋白結(jié)合的鐵，它以高鐵的形式附著在血清 pl 球蛋白的轉(zhuǎn)遞蛋白上，成人正常值為 50－184μg/100mL。缺鐵性貧血時常低于 50μg/100mL，當(dāng)血紅蛋白濃度降低不明顯時，血清鐵已減少，被認(rèn)為是早期缺鐵性貧血診斷依據(jù)之一。

2.5.4.3.2.1 鉻天青 B 銨鹽比色法

鉻天青B 銨鹽作為顯色劑測血清鐵，比過去多采用的聯(lián)吡啶等作為顯色劑有較高的靈敏度，其克分子吸光系數(shù)在 630nm 波長下為 1.68×10 5 L·mol -1·cm-1?？纱蟠鬁p少樣品血清量，方法簡便，準(zhǔn)確。

2.5.4.3.2.1.1 原理

Fe 3／Fe 2 與鉻天青 B（CAB）和十六烷基三甲基溴化銨（CTMA）反應(yīng)，形成三元膠囊狀絡(luò)合物使試劑顏色加深，其顏色加深程度與血清鐵含量成正比，在 pH 為 4.6－5.5，波長為 630nm 時，有最大吸收峰，利用檸檬酸為鐵的掩蔽劑，樣品為自身空白，不需除蛋白，即可測出血清鐵的含量。

2.5.4.3.2.1.2 試劑

2.5.4.3.2.1.2.1 緩沖溶液 pH4.75，取 25g 無水醋酸鈉，110g 氯化鈉，8mL 冰醋酸，用蒸餾水定容至 1000mL。

用酸度計測pH 應(yīng)為 4.75。

2.5.4.3.2.1.2.2 顯色劑

2.5.4.3.2.1.2.2.1 0.1%鉻天青 B 銨鹽溶液（A 液）：取 0.1g 鉻天青 B 銨鹽，定容于 l00mL 蒸餾水中，放在棕色瓶中可在室溫下保存 1 個月。

2.5.4.3.2.1.2.2.2 0.3%十六烷基三甲基溴化銨（B 液）：取十六烷基三甲基溴化銨 0.3g，用蒸餾水定容至 100mL。

2.5.4.3.2.1.2.2.3 顯色劑應(yīng)用液：取 90mL B 液，60mL A 液，小心混勻，用緩沖溶液定容至 1000mL，放在棕色瓶內(nèi)可保存 1 個月。

2.5.4.3.2.1.2.3 掩蔽劑：稱 17.0g 檸檬酸（C6H8O7·H2O），35.0g 檸檬酸鈉（Na3C6H5O7·H2O），約加 50mL蒸餾水加熱助溶，冷卻后定容至 l00mL。

2.5.4.3.2.1.2.4 鐵標(biāo)準(zhǔn)液

2.5.4.3.2.1.2.4.1 貯備液：3mmol/L，取 1.176g 硫酸亞鐵銨（6 分子結(jié)晶水）至少量蒸餾水中，加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.2.1.2.4.2 工作液：30μmol/L，取 10mL 貯備液，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.2.1.3 方法

按下表加入各種試劑。

標(biāo)準(zhǔn)管光密度

2.5.4.3.2.1.5 注意事項

2.5.4.3.2.1.5.1 要求所用器皿用 2N 鹽酸浸泡過夜，試劑純度為分析純以上，所用蒸餾水為雙蒸水或去離子水。

2.5.4.3.2.1.5.2 緩沖液 pH 對結(jié)果影響較大，測定時 pH 應(yīng)保證在 4.70－4.80 之間。

2.5.4.3.2.1.5.3 嚴(yán)格限制波長的選擇（需經(jīng)校下），血清樣品在 607－609nm 之間有一個雜質(zhì)吸收峰。

2.5.4.3.2.2 原子吸收光譜法

用原子吸收光譜法測定生物樣品中微量元素的含量具有操作簡便、快速、靈敏度較高的優(yōu)點，故被廣泛應(yīng)用。

2.5.4.3.2.2.1 試劑

2.5.4.3.2.2.1.1 混合酸消化液：4 份硝酸，1 份高氯酸混合即成。

2.5.4.3.2.2.1.2 鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液

2.5.4.3.2.2.1.2.1 鐵標(biāo)貯備液：取 1.0000g 純金屬鐵，用鹽酸或硝酸溶解后，用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL，移入聚乙烯塑料瓶內(nèi)，存放在 4℃冰箱，1mL 含 1mg 鐵。

2.5.4.3.2.2.1.2.2 鐵標(biāo)工作液：取 10mL 貯備液，用 0.1N 鹽酸定容至 l00mL，lmL=l00μg 鐵。

2.5.4.3.2.2.2 操作

2.5.4.3.2.2.2.1 樣品收集及處理

取靜脈血2mL 于盛有 l0mg 草酸鉀的 5mL 試管中（于每試管中加入 0.2mL5%草酸鉀，置烘箱中烤干即成），離心（3000 轉(zhuǎn)/分）15 分鐘。將分離出的血漿吸入另一帶蓋小試管中，備用。

2.5.4.3.2.2.2.2 消化

取1.0mL 血漿，于 100mL 高型燒杯中，約加 3mL 混合酸消化液，上蓋表皿，放置數(shù)小時或過夜，在沙浴電熱板上徐徐加熱煮沸，在冒白色濃煙激烈作用后溶液呈無色或淡黃色。反應(yīng)終了，取下燒杯（若酸用量不夠，最后可出現(xiàn)溶液變黑現(xiàn)象，此時可再加 2 mL 混合酸消化液繼續(xù)消化直至五色）。冷卻后用 10－20mL

去離子水沖洗表皿和杯壁，除去表皿繼續(xù)加熱，直到再度冒白色濃煙，待溶液體積接近蒸干，殘留酸量不超過l mL，取下冷卻，用蒸餾水稀釋至 3mL。

2.5.4.3.2.2.2.3 測定

吸取0.0mL，0.5mL，1.0mL，2.0mL，3.0mL，5.0mL 鐵標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液，用 0.1N 鹽酸定容至 100mL，混合，各容量瓶中每 mL 分別相當(dāng)于 0μg，0.5μg，1μg，2μg，3μg，5μg 鐵。將處理后的樣液，試劑空白，鐵標(biāo)系列溶液分別導(dǎo)入火焰進(jìn)行測定，測定條件（Pekin-Elener403 型原子吸收分光光度計）：波長 248.3nm；空心陰極燈電流：30mA，狹縫寬 0.2mm，空氣流量 13.51/min，乙炔流量：5.21/分。以鐵含量對應(yīng)濃度吸光度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品鐵含量。

2.5.4.3.2.2.2.4 計算

式中：X─ 血漿中鐵的含量（μg/100mL 血清）。

A1─測定用樣品液中鐵的含量（mg/L）。

A2─測定空白液中鐵的含量（mg/L）。

V─樣品處理液定容總體積（mL）。

m─ 血漿取樣量（mL）

2.5.4.3.3 總鐵結(jié)合量測定

2.5.4.3.3.1 試劑

2.5.4.3.3.1.1 鐵標(biāo)準(zhǔn)液

2.5.4.3.3.1.1.1 鉻天青 B 銨鹽法

2.5.4.3.3.1.1.1.1 貯備液：（3mmol/L）取 1.176g 硫酸亞鐵銨（6 分子結(jié)晶水）置蒸餾水中，加 50mL 濃硝酸混勻反應(yīng) 10 分鐘，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.1.2 工作液：（30μmol/L）取 10mL 貯備液，用蒸餾水定容至 1000mL。

2.5.4.3.3.1.1.2 原子吸收分光光度法

2.5.4.3.3.1.1.2.1 貯備液：取 1.0000g 純金屬鐵，用鹽酸或硝酸溶解后，用 0.1N 鹽酸稀釋到 1000mL，移入聚乙烯塑料瓶內(nèi)，存放 4 oC 冰箱，1mL 含 1mg 鐵。

2.5.4.3.3.1.1.2.2 工作液：取 10mL 貯備液，用 0.1N 鹽酸定容至 100mL，1mL=100μg 鐵。

2.5.4.3.3.2 輕質(zhì)碳酸鎂（AR）（或堿式碳酸鎂）其質(zhì)量應(yīng)符合要求。

2.5.4.3.3.3 實驗步驟

2.5.4.3.3.3.1 應(yīng)用鉻天青 B 銨鹽方法測總鐵結(jié)合量

取0.1mL 血清放入尖底離心管，加 60μmol/L 鐵標(biāo)準(zhǔn)液0.1mL 充分混合，室溫放置 15 分鐘。再加 4－5mg 輕質(zhì)碳酸鎂，放置 15 分鐘，混合 3－4 次。然后以 3000轉(zhuǎn)/分離心 5－8 分鐘，取上清液 0.1mL 按鉻天青 B 銨鹽比色法測血清鐵的步驟進(jìn)行操作，計算。

2.5.4.3.3.3.2 原子吸收分光光度法測總鐵結(jié)合量取 1.0mL 血清，加鐵標(biāo)準(zhǔn)液（20μg/mL）0.5mL，充分混合，放置 15 分鐘。加 150mg 輕質(zhì)碳酸鎂，充分混勻 1 分鐘以上，放置 30 分鐘，混合 3－4 次。離心 10 分鐘，取上清液 1mL 按原子吸收分光光度法測血清鐵的操作步驟進(jìn)行消化，測定，計算。

2.5.4.3.3.4 計算

2.5.4.3.3.4.1 血清總鐵結(jié)合量可用（mg/100L）表示。

2.5.4.3.3.4.2 未飽和鐵量=血清總鐵結(jié)合量－血清鐵。

2.5.4.3.4 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

實驗數(shù)據(jù)可用方差分析，但需按方差分析的程序先進(jìn)行方差齊性檢驗，方差齊，計算F 值，F(xiàn) 值<F0.05，結(jié)論：各組均數(shù)間差異無顯著性；F 值≥F0.05，P≤0.05，用多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法進(jìn)行統(tǒng)計；對非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)或方差齊要求后，用轉(zhuǎn)換后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計；若變量轉(zhuǎn)換后仍未達(dá)到正態(tài)或方差齊的目的，改用秩和檢驗進(jìn)行統(tǒng)計。

2.5.4.4 紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉：見 1.6.2。

2.5.5 結(jié)果判定

受試樣品組與對照組比較，血紅蛋白升高且平均升高幅度≥10g/L，血清鐵蛋白增加，血清運鐵蛋白飽和度升高，紅細(xì)胞游離原卟啉降低，經(jīng)統(tǒng)計處理差異有顯著性，即可分別判定該指標(biāo)結(jié)果陽性。

2.6 數(shù)據(jù)處理及結(jié)果判定

試驗數(shù)據(jù)為計量資料，可用t 檢驗進(jìn)行分析。凡自身對照資料可以采用配對 t 檢驗，兩組均數(shù)比較采用成組 t 檢驗，后者需進(jìn)行方差齊性檢驗，對非正態(tài)分布或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行適當(dāng)?shù)淖兞哭D(zhuǎn)換，待滿足正態(tài)方差齊后，用轉(zhuǎn)換的數(shù)據(jù)進(jìn)行 t 檢驗；若轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)仍不能滿足正態(tài)方差齊要求，改用 t＇檢驗或秩和檢驗；但變異系數(shù)太大（如 CV>50%）的資料應(yīng)用秩和檢驗。

結(jié)果判定

改善兒童缺鐵性貧血：試驗前后自身比較和試驗后組間比較，血紅蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉二項指標(biāo)差異有顯著性；同時，試食組自身前后比較，血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L，可判定受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。

改善成人缺鐵性貧血：試驗前后自身比較和試驗后組間比較，血紅蛋白指標(biāo)差異有顯著性；同時，試食組自身前后比較，血紅蛋白平均升高幅度≥10g/L，血清鐵蛋白、紅細(xì)胞內(nèi)游離原卟啉/血清運鐵蛋白飽和度二項指標(biāo)中一項指標(biāo)陽性，可判定該受試樣品具有改善缺鐵性貧血的作用。